白晨，吴刚，张翼，陆红。HPLC分析胰岛素开链反应的教学实验设计。实验室研究与探索，2008，27(9)，17-19.pdf
白晨，吴刚，张翼，陆红。HPLC分析胰岛素开链反应的教学实验设计。实验室研究与探索，2008，27(9)，17-19.pdf
实 验 室 研 究 与 探 索 第 27 卷 第 9 期 2008 年 9 月 Vol. 27 No. 9 Sep. 2008 RESEARCH AND EXPLORATION IN LABORATORY HPLC 分析胰岛素开链反应的教学实验设计 a 白 晨 , a 吴 刚 , 张 a 翼 , b 黄铮宇 , 陆 红 a (复旦大学 a. 生物科学教学实验中心生物化学实验室 ; b. 信息科学与工程学院 ,上海 200433 ) 摘 要 : 设计 DTT还原胰岛素 , HPLC 再现 A、B 链开链反应过程的生物化学实验 。筛选出最适还原反 应条件 ,最佳 HPLC 分离条件 。通过质谱 (MALD I2TOF 2M S)分析确定了产物的结构 。实验操作简便 ,结 果稳定 ,再现性好 ,通过本实验学生能更好地理解和掌握 HPLC 的分析原理 、 操作方法及其在生命科学 研究中的重要意义 。 关键词 : 高校液相色谱 ; 胰岛素 ; 二硫苏糖醇 中图分类号 : Q5 文献标识码 : A 文章编号 : 1006 - 7167 ( 2008 ) 09 - 0017 - 03 A Teaching Expe rim ent on HPLC Ana lysis of Insulin U nfo lding a BA I Chen , a WU Gang , a ZHAN G Y i , HUAN G Z heng 2yu , b a LU Hong ( a. Labo ratory of B iochem istry, Teaching Center of B iology; b. School of Information Science and Engineering, Fudan Univerisity, Shanghai 200433, China ) Abstract: This article designed an experim ent where insulin was first reduced and unfolded by DTT, and then HPLC was used to rep resent the A and B chains. It developed the mo st p robable conditions for the reduction reaction, found the best HPLC isolation method, and made a confirmation of each samp le using MALD I2TOF 2M S. The experim ent is easy to perform , the result is invariable, and in addition, it has a desired rep roducibility. It is helpful for college students to have a better understanding of the HPLC p rincip les, to master the ways to operate it, and the im portance of its role in life science research. Key words: HPLC; insulin; DTT CLC num ber: Q5 D ocum en t code: A Article ID : 1006 - 7167 ( 2008 ) 09 - 0017 - 03 高效液相色谱 ( HPLC ) 具有分离速度快 , 灵敏度 高等特点 ,是现代仪器分析的重要组成部分 。无论在 环境科学 、 生命科学 、 医学研究中都显示出其优越性 , [1] 现已成为自然科学研究中必不可少的基本仪器 。 近几年 ,多数高校的生物化学教学增添了 HPLC 分析 原理 、 基本操作方法等理论教学内容 。部分院系为增 加学生的感性认识还采用多媒体教学 、 计算机虚拟实 [2] 验系统 让学生完成 HPLC 的实验演练 。但是上述教 学内容这很难让学生真正理解和掌握仪器高效率 、 高 灵敏度特征 , 更不可能达到熟练操作的目的 。由于 HPLC 属于高价科研仪器 , 在管理 、 实验内容上较为复 收稿日期 : 2008 - 01 - 02 基金项目 : 国家基础科学人才培养基金 ( J0630643 ) 资助 作者简介 : 白 晨 ( 1969 - ) , 女 , 博士 , 副教授 , Tel: 021 265643674; E 2mail: baichen@ fudan. edu. cn 杂、 目前尚未见到将其应用于本科生教学实验的报道 。 为了顺应生命科学的快速发展 , 设计一例简便易 行、 结果明显 、 稳定并能与生物化学理论知识紧密结合 的 HPLC 本科生教学实验显得非常必要 。 胰岛素不仅是重要的生物学活性蛋白质 , 同时具 有分子量低 、 结构简单 、 性质稳定 、 已商品化生产 、 纯品 价格便宜等特点 ,是非常适合本科生生物化学教学实 验的蛋白质原料 。学生对胰岛素非常熟悉 , 国内常用 生物化学教材中的糖代谢 、 糖尿病部分都涉及到了胰 岛素 。 Sanger测定胰岛素序列的方法是生物化学教材 中蛋白质测序章节的经典范例 。我国合成结晶牛胰岛 素的研究过程是蛋白质合成部分的生动教学案例 。通 过理论教学学生对胰岛素的物理化学性质 , 生理生化 特性理解得较为全面 、 透彻 。 RP 2HPLC 主要根据疏水性差异分离蛋白质 , 是目 [3] 前分离 、 鉴定蛋白质和多肽最常用的方法之一 , 并 实 验 18 室 研 究 与 探 被用于人工 合 成 及 生 物 体 内 胰 岛 素 含 量 的 精 确 定 [ 4, 5 ] 量 、、胰 岛 素 在 细 胞 内 的 降 解 途 径 分 析 等 研 究 [6] 中 。欧洲和美国的药典已将 HPLC 作为胰岛素鉴定 索 第 27 卷 处的 DTT 洗 脱 峰 外 , 产 物 的 洗 脱 峰 出 现 在 9 到 15 m in,其中胰岛素 B 链保留时间为 13. 551 m in. [7] 的标准方法 。 本文首先用高浓度 DTT 充分还原胰岛素 。为排 出了中间体和不稳定 A 链对实验结果的干扰 , 将分析 [8] 结果锁定稳定性较高的 B 链 。通过质谱 (MALD I2 TOF 2M S)分析 HPLC 洗脱峰确立了反应条件 。通过优 化 HPLC 洗脱条件得到了稳定 、 明显 、 对称的产物洗脱 峰 。整个实验时间控制在 6 h 以内 , 操作简便 , 可重 复性高非常适合在本科生实验教学中应用 。 图 2 胰岛素标准品洗脱峰 1 实验部分 1. 1 实验流程 图 1 实验流程 1. 2 仪器与试剂 ( 1 ) 仪器 。Agilent 1100 LC 高效液相仪 , Z0RBAX 300SB 2C18高 效 液 相 柱 , AX IMA 2Q IT 质 谱 仪 ( A SH I2 图 3 DTT处理后的胰岛素洗脱峰 MADZU GROUP COM PANY ) , 精密电子天平 , 真空干 燥机 ,电热恒温水浴锅 , pH 计 。 ( 2 ) 试剂 。猪胰岛素为分析纯 (徐州万邦生化制 药有限 公司 ) , ACN 为 色谱 纯 , TFA 为 分 析 纯 ( SIG2 MA ) , DTT为分析纯 , BHD ( 2, 5 2dihydroxybenzoic acid ) 为色谱纯 ,蒸馏水为色谱纯 。 1. 3 实验步骤 ( 1 ) DTT 还原胰岛素 。胰岛素溶液为 1 m g /mL 胰岛素溶液 ,用 2 N 盐酸调 pH 至 2. 5。DTT还原试剂 为 200 mM DTT, 0. 01M 乙酸钠 , 用 2 N 盐酸调 pH 至 2. 5。分别取 50 μL 胰岛素溶液及 DTT 还原试剂于 Eppendorf管中混匀 ,往管中充满氮气 ,用 parafilm 膜密 封管口 , 37 ℃水浴 3 h。 ( 2 ) HPLC 分析胰岛素还原产物 。洗脱液平衡 HPLC30 分后取还原反应液 5 μL 进样分析 , 收集洗脱 峰 。取胰岛素标准品溶液 10 μL 作对照分析 。 HPLC 洗脱条件 : 流动 相 为 34% 的 乙 腈 水 溶 液 (含 0. 1% TFA ) ; 柱温为 25 ℃; 流速为 0. 8 mL /m in; 检测波长为 3 讨 论 本科生教学实验必须具有理论依据明确 、 操作步 骤简便 、 结果稳定 、 再现性高等特点 。本实验设计中为 了达到上述要求 ,对 DTT还原反应条件 、HPLC 洗脱条 件、 洗脱产物的确定三个关键部分做了深入细致地探 讨。 3. 1 D TT 还原反应条件的确定 由于胰岛素在酸性条件下溶解性较好 , 本实验选 择在酸性条件下还原胰岛素 , 反应体系 pH 值为 2. 5。 在此条件下 , DTT的用量比常规用量有所增加 。但是 鉴于 DTT还原二硫键的速度与溶液 pH 值 、 温度呈正 相关 ,为加快反应速度将反应温度定为 37 ° C。 [8] 董标 等在毛细管区带电泳监测牛胰岛素的去 折叠过程研究中发现用 DTT处理胰岛素除了生成 A、 B 链外 ,还有不稳定的中间体 。中间体的种类和含量 跟 DTT浓度 , pH 值 ,温度和反应时间相关 。开链后 A 4. 319 m in. DTT还原后的胰岛素洗脱峰如图 3 所示 。 链十分不稳定 ,其有无与反应时间相关 ,超过一定的反 应时间后胰岛素的 A 链会完全消失 。本实验研究中 发现同样问题 , A 链十分不易检测 ,导致不同实验组实 验结果出现较大差异 , 增加了学生操作实验和分析实 验结果的难度 。为此 , 我们通过对比实验筛选了 DTT 对照二次 HPLC 分析结果可以发现图 3 中 4. 319 m in 处已无明显出峰 ,说明胰岛素已经被 DTT完全还原开 链 ,产物中已无完整的胰岛素分子存在 。除 3. 681 m in 还原胰岛素反应的最佳保温时间 。具体操作是将胰岛 素和 DTT的反应混合物在 37 ℃温育 ,利用 HPLC 分析 反应时间分别为 0. 5, 1, 2, 3, 4 h 的反应产物 。结果发 230 nm。 2 实验结果 胰岛素标准品洗脱峰如图 2 所示 , 保留时间为 白 第 9期 晨 ,等 : HPLC 分析胰岛素开链反应的教学实验设计 19 现温育 3 h 后 , HPLC 洗脱杂峰少 , B 链洗脱峰明显 ,实 验结果稳定 。故选择 3 h 作为还原时间 , 并将产物峰 单一锁定 B 链峰 ,排出 A 链峰对实验结果的干扰 。 3. 2 HPLC 洗脱条件的优化 HPLC 洗脱条件的优化包括洗脱液配比 , UV 检测 [9] 波长确定两个部分 。董方霆 等报道了用 HPLC 分析 DTT还原胰岛素的方法 。但 HPLC 洗脱峰不明显 , 峰 形不对称 ,为获得更为清晰稳定的 HPLC 产物峰 , 我 们将 HPLC 洗脱条件进行了一系列的优化 。通过调节 洗脱液中乙腈的浓度将总洗脱时间控制在 20 m in 以 内 ,最后出现的 B 链峰保留时间约为 14 m in。通过添 加 TFA 稳定基线 、 使副产物与产物峰达到完全分离 , 最后将 HPLC 洗脱液配比确定为 : 34%乙腈水溶液 (含 0. 1% TFA ) 。在 UV 检测波长的选择方面 ,我们也作了 相关探讨 。将胰岛素和其还原产物作连续波长扫描发 现 ,在 230 nm 处样品峰最明显 , 杂峰最小 ,故选择 230 nm 作为 HPLC 检测波长 。 3. 3 洗脱产物的确定 本实验采用的实验室最为常用的 ODS反相 HPLC 层析柱 ,其分离效果与样品的疏水性 、 分子量大小均有 相关性 。胰岛素经 DTT处理开链后分子量减小 ,巯基 暴露可能使产物的保留时间小于完整的胰岛素分子 。 但是分子内部的疏水侧链暴露又可能引起增保留时间 的延长 。为了确定 HPLC 洗脱峰确系胰岛素和胰岛素 B 链 , 我们将洗脱峰作了质谱分析 。结果表明 4. 319 m in 洗脱峰为分子量 5734. 01 (见图 4 ) , 13. 551 m in 洗 脱峰分子量为 3400. 57 (见图 5 ) , 分别与胰岛素及胰 岛素 B 链分子量准确相符 。 图 5 胰岛素 B 链质谱鉴定结果 [ 8, 9 ] 了一些小峰 。这些物质可能是反应中间体 , 也可 [8] 能是残留的 A 链 。质谱结果显示 ,该时间段流出物 质在 2000 ～3500 范围内检测到多个分子离子峰 ,但是 在 mass/ charge 5734 处没有分子离子信号 , 在 A 链理 论分子量 2334 处也没有明显的分子离子信号 ,可以初 步推断这些物质不存在 A 链 ,极可能是反应副产物 。 参考文献 ( References) : [ 1 ] 谢一凡 . 重视高效液相色谱法的实验教学 [ J ]. 山西医科大学学 报 (基础医学教育版 ) , 2003, 5 ( 3 ) : 291. 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